第一作者：陈佳伟张轩

通讯作者：朱咏华

作者单位：湖南大学生物学院；湖南省林业科学院

图片摘要

成果简介

最近，环境领域著名期刊Journal of hazardous materials发表了湖南大学和湖南省林业科学院的最新合作研究成果“EndophyticEnterobactersp. YG-14 mediated arsenic mobilization through siderophore and its role in enhancing phytostabilization”。研究通过构建YG-14铁载体—肠杆菌素合成基因缺失突变体（ΔentD），证实内生菌通过分泌铁载体有效促进了矿物土壤中铁砷络合物的活化，释放可被生物利用的铁和砷到根际中，进一步通过胞外聚合物和特定的磷酸酶转移蛋白PitA吸附和吸收环境中的砷，最终通过定殖的方式将环境中的砷固定在修复植物根部，实现土壤砷污染植物根部固定修复。研究从表型、生理生化和分子水平揭示了内生菌在促进修复植物固定砷和维持宿主植物生长中的重要作用。

引言

砷作为高度致癌的类金属元素，被国际癌症研究中心（IARC）正式列为I类致癌物。有色金属矿的开采和冶炼是全世界砷污染的主要来源之一，占全球砷总排放量的24.04%，极大地威胁着人类健康乃至生态系统安全，引发了全球性关注。然而，与镉、铅和锌等金属阳离子不同，砷常以胶体形态被铁、铝或锰的氧化物固定在土壤中，尤其我国南方红壤具有富铁铝的特性，导致砷成为难以被修复植物直接吸收的固定态砷，极大削弱了植物修复的有效性。因此，本研究利用了一种细菌分泌的铁载体解吸土壤中的砷，进而增强植物对砷的根部固定能力。目前，从分子水平揭示内生菌次生代谢产物作用于土壤重金属修复的研究还十分有限。本研究以铁载体为切入点，通过全面揭示内生细菌在促进植物根部固定砷和维持宿主植物生长中的作用，为利用内生菌次数代谢产物创新重金属修复方法提供了绿色高效的新策略。

图文导读

植物内生肠杆菌Enterobacter sp.YG-14的砷耐受能力及其砷活化能力

本研究利用从矿区重金属耐性植物体中分离出的一种具有多种重金属吸附能力的肠杆菌（Enterobacter sp.YG-14）（授权专利ZL201810719544.1），通过菌株生理生化特征和土壤接种实验发现YG-14具有很好的砷酸盐和亚砷酸盐耐受能力。液体发酵实验发现YG-14能够很好的吸附和吸收环境中游离的砷酸根离子，其在120mg/L的砷酸盐胁迫时对于砷酸根的吸附和吸收量分别达到156.09和33.02mg/kg。为进一步研究YG-14对南方红壤中砷铁化合物的影响，我们通过土壤接种实验发现YG-14能够显著提高土壤中游离态砷和铁的含量。

图1. A-B.YG-14对砷酸盐和亚砷酸盐的耐受能力；C-D.不同砷浓度下YG-14对环境中砷酸盐的吸附和吸收能力；E.120mg/L砷酸盐环境下YG-14的pitA基因的表达量;F-I.不同砷酸盐浓度下YG-14对南方红壤中砷的活化能力。

enterobactin对于土壤中砷铁化合物的影响

生物信息学预测和质谱鉴定结果表明YG-14可以分泌异羟肟酸类铁载体aerobactin和儿茶酚类铁载体enterobactin。其中，YG-14的enterobactin产量为0.322 g/L。进一步使用Red/ET技术得到了enterobactin合成能力缺乏型菌株ΔentD。

图2. A-D. YG-14和ΔentD对水溶态砷、可交换态砷、非晶体的铁铝结合态砷以及游离氧化铁的影响；E. YG-14和ΔentD在土壤中entD基因的表达量；F. YG-14和ΔentD在土壤中tolC基因的表达量；G. YG-14和ΔentD在土壤中fepA基因的表达量；H. YG-14和ΔentD在土壤中pitA基因的表达量。

土壤接种实验证实，缺失enterobactin合成能力后，YG-14对土壤中砷和铁的活化能力下降，且enterobactin主要活化非晶体的铁铝结合态砷，对于更加稳定的晶体的铁铝结合态砷和残余态的砷影响不明显。RT-qPCR基因表达量测定发现ΔentD中，尤其是enterobactin的特异性受体(fepA)和砷吸收相关基因(pitA)表达下调，进一步说明了ΔentD难以活化铁砷化合物。

enterobactin植物根部固定砷的影响

通过盆栽实验进一步探究了由enteriobactin活化的砷和铁如何固定在植物体中的。实验结果表明刺槐根部的砷和铁的含量随着YG-14在刺槐根部的定殖量水平提高而增加，提示刺槐根部的砷固定能力可能与YG-14的定殖有关。此外，通过将YG-14和ΔentD接种于刺槐根部的对比研发发现，enterobactin的分泌也与砷的植物固定存在正相关关系。

图3. A.培养60天后接种了YG-14或者ΔentD的刺槐生长情况；B-C.接种YG-14或者

ΔentD的刺槐地下部分和地上部分砷含量变化；D-E.接种YG-14或者ΔentD的刺槐地下部分和地上部分铁含量变化；F.刺槐地下部分YG-14或者ΔentD定殖量。

YG-14接种有效提高植物宿主的砷耐受水平

为了探究YG-14促进刺槐根部砷固定是否对刺槐造成损害，测定了接种了YG-14的刺槐根部过氧化氢含量以及抗氧化相关酶的活性。结果表明砷含量和YG-14定殖水平的提高会造成过氧化氢含量提高。但是，YG-14的定殖也促进了刺槐根部抗氧化酶活性的提高，以更好的保护植物细胞免受氧化损伤。同时，YG-14的定殖促进了谷胱甘肽还原酶(GR)活性水平提高，使得刺槐根部产生更多的还原型谷胱甘肽(GSH)，有助于刺槐更好的抵御高砷胁迫带来的损伤。

图5. A.接种了YG-14后刺槐根部过氧化氢含量；B-D.接种了YG-14后刺槐根部抗氧化酶活性；E.接种了YG-14后刺槐根部GR活性；F-G.接种了YG-14后刺槐根部GSH和GSSG含量变化。

小结

研究从表型、生理生化和分子水平系统揭示了内生细菌通过分泌铁载体enterobactin活化南方红壤中的砷铁化合物，并以定殖方式提高修复植物根部固定水平，最终实现土壤砷污染植物修复的目的。论文为今后利用微生物次生代谢产物开展环境污染治理提供了有价值的参考。

该研究得到了国家自然科学基金的资助。特别感谢湖南大学生物学院、湖南省林业科学院省部共建木本油料资源利用国家重点实验室提供的技术和经费支持。

通讯作者简介

朱咏华:教授，博士生导师。研究方向资源与环境微生物的研发和植物—微生物相互作用研究。主要涉及协助植物抗逆和促生的内生菌研究；具有降解环境废弃物能力的内生菌研究；特色植物内生菌的研究。先后主持与参加了国家自然科学基金、国家重大专项子项目、湖南省科技重点项目等共20余项科研课题，作为主要研究人员之一获湖南省科技进步二等奖2项。先后在Journal of Cleaner Production、mbio、The Journal of Biological Chemistry、Biotechnology for Biofuels等国内外知名刊物上发表学术论文50余篇，作为第一发明人获得授权专利7项。

第一作者简介

陈佳伟：男，硕士毕业于湖南大学生物学院（导师朱咏华）。

张轩：湖南省林业科学院副研究员，硕士毕业于湖南大学生物学院（导师朱咏华）主要从事重金属污染土壤生物修复、森林与湿地生态保护以及相关的林业科研工作。先后主持国家自科基金等科研项目10余项；作为第一发明人授权专利4项；发表论文30篇，其中第一作者（含通讯）SCI论文9篇；参与制定地方标准1项。